該模型的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變?cè)u(píng)分值，該模型與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的經(jīng)典cornell模型類似，但是cronell模型的問(wèn)題在于模型潛伏期荷菌量過(guò)高，復(fù)發(fā)期3-9個(gè)月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問(wèn)題，模型均一，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過(guò)低也不過(guò)高），周期明顯縮短，由3-9個(gè)月不等的周期縮短到比較穩(wěn)定的10周，便于應(yīng)用。

該模型不僅可以用于潛伏及復(fù)發(fā)的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復(fù)發(fā)期研究疾病機(jī)制，同時(shí)可以用于評(píng)價(jià)潛伏感染的預(yù)防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動(dòng)物模型的制備的設(shè)計(jì)得到研究所IACUC委員會(huì)的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實(shí)驗(yàn)人員，全程在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測(cè)的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無(wú)安全事故。

1. 荷菌量檢測(cè)結(jié)果

結(jié)核活動(dòng)性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進(jìn)入潛伏期，肺脾肝荷菌量為0，治療后自然復(fù)發(fā)及誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后肺脾肝荷菌量明顯升高，其中誘導(dǎo)后復(fù)發(fā)水平更高，以活動(dòng)期的同期肺荷菌量為對(duì)照（control）。在感染不同階段檢測(cè)肺脾肝組織的荷菌量值與個(gè)感染期的菌復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)吻合。其中肺組織荷菌量為判斷的主要標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如下：

圖2 潛伏期和再發(fā)期肺組織的荷菌量

左圖：肺組織的潛伏期荷菌量的對(duì)數(shù)，右圖是復(fù)發(fā)期各組的肺組織荷菌量。**P<0.01,***P<0.001

2. 病理病變結(jié)果

結(jié)核活動(dòng)性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進(jìn)入潛伏期，肺脾肝病理病變明顯減輕，治療后自然復(fù)發(fā)及誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后肺脾肝病變加重，其中誘導(dǎo)后復(fù)發(fā)水平更明顯，以活動(dòng)期的同期肺病變?yōu)閷?duì)照（control）。在感染不同階段檢測(cè)肺脾肝組織病變?cè)u(píng)分與個(gè)感染期的菌復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)吻合。其中肺組織病變?yōu)榕袛嗟闹饕獦?biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如下：

圖3 潛伏期和再發(fā)期肺組織的病變?cè)u(píng)分

左圖：肺組織的潛伏期肺病變?cè)u(píng)分，右圖是復(fù)發(fā)期各組的肺病變?cè)u(píng)分。**P<0.01,***P<0.001

3. 模型的評(píng)價(jià)

本模型采用的評(píng)價(jià)主要采取以整體表觀效度的評(píng)價(jià)方法，核心指標(biāo)是每個(gè)感染期的組織病變和荷菌量，根據(jù)結(jié)核病的不同感染期標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)來(lái)評(píng)估。比如小鼠感染后前兩周，表現(xiàn)為活動(dòng)性結(jié)核模型，肺脾肝組織有明顯的病變，荷菌量達(dá)到104CFU以上，用抗結(jié)核藥物治療一個(gè)月后，與臨床上治療對(duì)應(yīng)，小鼠中活動(dòng)性結(jié)核菌被殺滅，剩余的菌潛伏在肺脾肝組織中，表現(xiàn)為組織荷菌量呈極低水平，有些小鼠的荷菌量可為0值，與此同時(shí)，肺脾肝組織的病變減輕，表現(xiàn)為輕微炎癥或無(wú)明顯病變，綜合組織荷菌量和病變指標(biāo)，可以判斷此階段較好的模擬臨床上潛伏感染狀態(tài)。值得注意的是，該階段與治愈的區(qū)別在于，潛伏后小鼠可以自然或通過(guò)誘導(dǎo)劑引起肺脾肝組織中結(jié)核菌復(fù)燃，結(jié)核再活動(dòng)，表現(xiàn)為荷菌量反彈升高，呈現(xiàn)明顯的病變。

4.模型的驗(yàn)證

通過(guò)設(shè)置無(wú)治療的感染對(duì)照組，以及無(wú)誘導(dǎo)劑的對(duì)照組，可以判斷，治療后小鼠處于潛伏期，誘導(dǎo)后潛伏的結(jié)核菌可導(dǎo)致結(jié)核的再發(fā)。

另外的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)設(shè)置不同的治療方案，比如單用抗結(jié)核化療藥異煙肼，以及異煙肼搭配免疫制劑PD-L1抗體，與對(duì)照組比較，綜合判斷復(fù)發(fā)期的起始時(shí)間點(diǎn)、荷菌量水平、病變程度，來(lái)確定治療效果。

本模型已至少通過(guò)3個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)來(lái)重復(fù)驗(yàn)證，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定。

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 試劑

1）LEAFTM Purified Anti-Mouse TNF-α(Biolegend，美國(guó))

2）Isoniazid(Sigma，美國(guó))

3）蘇木精-伊紅染料（HE染料）

5）0.01M PBS等

6）FBS（Life TechnologiesCorporation，USA）

8）4%多聚甲醛

9）75%醫(yī)用消毒酒精（北京貞玉民生藥業(yè)有限公司）

10）分支桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管中性羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）

11）Trizol（Invitrogen）

12）二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）

13）一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿（康寧 ）

14）眼科剪（經(jīng)高壓滅菌）15）眼科鑷（經(jīng)高壓滅菌）16）EP管（1.5mL）（Axygen）

17）胰島素注射器（BD,美國(guó)）

18）1mL注射器（雙鴿，中國(guó)）

19）組織研磨器（美天旎，德國(guó)）

2. 儀器設(shè)備

1）數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)

2）NanoZoomerS60明場(chǎng)熒光切片掃描儀（日本）

3）溫控水浴鍋(北京市六一儀器廠)

4）超低溫冰箱(三洋，日本)

5）低溫高速離心機(jī)(BECKMAN，美國(guó))

6）臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭離心機(jī)廠)

7）可調(diào)微量1ml, 200ul, 100 ul, 20ul, 10 ul移液器(Gilson公司)

8）Ⅱ級(jí)生物安全柜（哈爾濱東聯(lián)哈爾）

9）渦旋振蕩器（QILINBEIER,QL-861）

10）960 Bacteria MGIT系統(tǒng)（BD，美國(guó)）

11）細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀（廣東體必康生物科技有限公司，中國(guó)）

12）高速低溫離心機(jī)（Thermo Scientific）

13) 組織研磨器（美天旎，德國(guó)）

14）電子天平（Ohaus Corp·PineBrook，USA）

15）組織脫水機(jī)（Leica）

16）石蠟包埋機(jī)（Leica）

17）石蠟切片機(jī)

18）電磁爐

（二) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（三）動(dòng)物感染和取材 固定小鼠于小鼠固定器中，暴露小鼠鼠尾，用75%酒精棉球擦拭鼠尾以暴露尾靜脈， 以1.0×107CFU/mL的 H37Rv 200uL/只尾靜脈感染C57BL/6小鼠，兩周之后給予異煙肼（10mg/kg）連續(xù)治療四周，之后TNF-α抗體（50ug/只/周）誘導(dǎo)四周。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組分別取4只小鼠脫頸椎處死，解剖取脾臟、肺臟、肝臟組織進(jìn)行荷菌量的檢測(cè)和病理分析，所有的實(shí)驗(yàn)均在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室（ABSL-3）進(jìn)行操作。

（四）組織荷菌量檢測(cè) （1）生物安全柜中，用眼科鑷取左側(cè)肺組織、脾頭1/3及肝靠腹背部的小葉部分用于組織研磨。 （2）組織依次用生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，加1mL生理鹽水到研磨器中研磨，各組織研磨的勻漿液分別取100μL，用生理鹽水按照1：10的比例進(jìn)行梯度稀釋5個(gè)濃度梯度，分別是10-1，10-2，10-3，10-4，10-5。 （3）取合適的三個(gè)稀釋度的組織稀釋液50或100μL，接種在分支桿菌中性羅氏培養(yǎng)管中，使組織研磨液能夠充分的被固體培養(yǎng)基吸收，每個(gè)梯度各接種3管。 （4）將接種好的組織培養(yǎng)基的羅氏固體培養(yǎng)基置于斜面上，之后置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4周進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 （五） 組織病理分析 余下的脾、肺、肝組織置于4%中性甲醛固定液中固定一周后，脾臟和肝臟組織分別按長(zhǎng)軸最大橫切面進(jìn)行修塊，肺組織完整分離小肺葉。 按照常規(guī)石蠟切片制作方法包埋、修塊、制片，HE染色后分析組織病理病變，HE片用NanoZoomer S60明場(chǎng)熒光切片掃描儀進(jìn)行明場(chǎng)半自動(dòng)掃片，掃完的HE片子用專用固態(tài)硬盤(pán)拷出，用VDP.View 2軟件對(duì)病變組織進(jìn)行定量分析。 病理診斷和分析由至少兩名病理資深診斷專家采取雙盲方法讀片和給出報(bào)告。分析單位面積（mm2)的肺組織中肉芽腫面積，單位面積（mm2)脾臟內(nèi)白髓內(nèi)肉芽腫的面積，單位面積（mm2)肝臟內(nèi)肉芽腫個(gè)數(shù)。 （六）數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s ) 表示。采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果采用單因素方差分析( One-way ANOVA)，t檢驗(yàn)和Tukey 檢驗(yàn)分析組間差異是否顯著，P <0.05認(rèn)為差異有顯著性。

一、疾病概述

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌感染后所致的疾病，結(jié)核分支桿菌感染后約90%以上的人群不發(fā)病，呈隱性感染，即潛伏感染，約10%的人群感染后形成活動(dòng)性結(jié)核病，多見(jiàn)肺結(jié)核，少量人群出現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、腸結(jié)核、骨結(jié)核、淋巴結(jié)核和眼結(jié)核等。

肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)較為明顯，有咳嗽咳痰，午后低熱盜汗，嚴(yán)重者有咯血等表現(xiàn)，通過(guò)結(jié)核菌素的皮試陽(yáng)性，痰菌培養(yǎng)陽(yáng)性以及胸片學(xué)變化可以診斷肺結(jié)核。對(duì)于一部分痰培養(yǎng)陰性的結(jié)核患者，綜合臨床變現(xiàn)、皮試、胸片結(jié)果及其他血液學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)輔助診斷，特殊情況下可以進(jìn)行治療性診斷。

Dannenberg等將結(jié)核菌感染和發(fā)病的生物學(xué)過(guò)程可分為起始期、T細(xì)胞反應(yīng)期、共生期和細(xì)胞外繁殖傳播期。侵入呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。細(xì)菌在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制，便擴(kuò)散至鄰近非活化的肺泡巨噬細(xì)胞和形成早期感染灶。否則若被殺滅，則不留任何局部證據(jù)。在T細(xì)胞反應(yīng)期，結(jié)核菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的最初生長(zhǎng)，形成中心呈固態(tài)干酪壞死的結(jié)核灶，它能限制結(jié)核菌繼續(xù)復(fù)制。由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（cell?mediatedimmunity，CMI）和遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（delaytype hyperensitivity，DTH）在此形成，從而對(duì)結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。大多數(shù)感染者發(fā)展至T細(xì)胞反應(yīng)期，僅少數(shù)發(fā)生原發(fā)性結(jié)核病。大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪性中央部位被認(rèn)為是持續(xù)存在的主要場(chǎng)所。低氧、低pH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動(dòng)和增殖，大量結(jié)核菌從液化干酪灶釋放形成播散。

活動(dòng)性結(jié)核通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的短程化療可以治愈，然而由于治療期較長(zhǎng)，有些病人并不能很好的堅(jiān)持全程化療，在治療一個(gè)月后，結(jié)核的癥狀基本消失，但是機(jī)體中依然潛伏有少量結(jié)核菌，機(jī)體免疫正常時(shí)，可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都不出現(xiàn)癥狀發(fā)病，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，潛伏在體內(nèi)的結(jié)核菌大量復(fù)制增殖，表現(xiàn)為結(jié)核病的再活動(dòng)。

二、模型背景

1、結(jié)核菌菌株信息

本模型所用的病原菌為結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，是國(guó)際公認(rèn)的模型用菌株，該菌株為單細(xì)胞克隆，基因序列已知，對(duì)抗結(jié)核藥物敏感。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

本模型所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，4-6周齡的雌性小鼠。C57小鼠對(duì)結(jié)核菌比較敏感，并且該品系小鼠是很多基因工程小鼠的背景小鼠，便于進(jìn)行結(jié)核病的機(jī)制研究。此外，小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，相應(yīng)的免疫試劑比較齊全，而且動(dòng)物成本相對(duì)較低，飼養(yǎng)的空間要求較其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低，易于開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

3、研究背景

該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

治療后潛伏感染及再發(fā)的模型，主要模擬臨床上活動(dòng)性結(jié)核病人治療后，癥狀消失，但是未徹底清除體內(nèi)潛伏結(jié)核菌，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，潛伏的結(jié)核菌復(fù)燃，結(jié)核病再活動(dòng)的病人。該模型，不僅可用于潛伏感染的疫苗評(píng)價(jià)，潛伏期預(yù)防性治療的藥物和方案評(píng)價(jià)，還可以通過(guò)比較不同感染期，研究潛伏感染的早期診斷分子，疾病再發(fā)的機(jī)制。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的治療后潛伏及再發(fā)的小鼠模型，即Cornell模型，該模型周期較長(zhǎng)，潛伏期的組織菌量較高，可達(dá)到103以上的數(shù)量級(jí)，不能很好的模擬人群中潛伏的狀態(tài)，此外，潛伏期后再發(fā)的時(shí)間和水平存在組內(nèi)個(gè)體差異大的問(wèn)題，因此，已有的模型需要優(yōu)化，以便更能模擬潛伏和再發(fā)的狀態(tài)，同時(shí)盡量使模型的組內(nèi)均一性提高，縮短模型的周期，便于實(shí)際應(yīng)用。

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