Nap1l5敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細胞中都不表達該基因的小鼠模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點在于其對基因進行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補配對。

NAP1L5(Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與NAP1L5相關(guān)的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。其主要在兒童發(fā)育時期發(fā)揮功能，引起一些疾病，而對于該基因在人類衰老階段是否會在心腦血管疾病中發(fā)揮功能卻鮮有研究，該研究為Nap1l5的研究提供了新的方向與思路。

模型動物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設(shè)計。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實驗準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機房和配電室等。

（2）設(shè)計參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動物實驗室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級過濾器后進入實驗室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養(yǎng)室、實驗準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關(guān)，根據(jù)實際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因為SPF級動物實驗室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機保持聯(lián)系，保證實驗室內(nèi)外信息的及時溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機，能夠及時了解設(shè)施的運行狀態(tài)；也能有效督促實驗人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態(tài)和反應(yīng)進行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實驗準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實驗動物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對SPF級動物實驗室使用獨立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機房控制室安裝風(fēng)機故障警報系統(tǒng)，以便及時檢修和維護，保證設(shè)施的安全運行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

因現(xiàn)階段小鼠模型仍處于繁育階段，所以相關(guān)實驗主要集中在細胞上。

為了探究Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們首先檢測了PE誘導(dǎo)的肥厚的心肌細胞中的Nap1l5中的mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)Nap1l5在PE誘導(dǎo)的肥厚的心肌細胞中的表達顯著上調(diào)（圖1A），同時發(fā)現(xiàn)在TAC術(shù)后的心肌肥厚模型中Napll5的表達同樣顯著上調(diào)（圖1B），說明Nap1l5在心肌肥厚的發(fā)生中可能發(fā)揮重要功能。

為了進一步驗證Nap1l5在心肌肥厚中的功能，我們通過siRNA對心肌細胞中的Nap1l5進行了敲低，圖1C為敲低水平的檢測，證明siNap1l5能夠顯著敲低Nap1l5的表達；敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平明顯受到了抑制，而Myh6卻明顯上調(diào)（圖1D）；而Nap1l5的過表達正好有相反的結(jié)果（圖1F），說明Nap1l5在體外確實可以促進心肌細胞的肥厚。

總之，研究結(jié)果表明，敲低Nap1l5可以緩解心肌肥厚的發(fā)生，而過表達Nap1l5可以促進心肌肥厚的發(fā)生。

圖1. Nap1l5 可以促進心肌肥厚。（A、B）Nap1l5及心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh7和Myh6在PE處理的心肌細胞及心臟TAC模型中的mRNA的相對表達水平；（C）Nap1l5敲低水平檢測；（D）敲低Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平；（E）過表達Nap1l5的水平檢測；（F）過表達Nap1l5后，心臟組織心肌肥厚標(biāo)志物Anp、Bnp、Myh6在心肌細胞中的mRNA的相對表達水平；*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs Control（A）、Sham（B）、siNeg（C、D）、AdEGFP（E、F），P < 0.05，## P < 0.01，### P < 0.001 vs Control組。

鑒定結(jié)果解讀：

Ⅰ. 65#, 67#, 72#, 80#, 81#純合；

Ⅱ. 57#, 77#野生型；

1 項目策略圖

2 項目策略概述 利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄 gRNA，將 Cas9、 gRNA 同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9 蛋白在 gRNA 引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點進而造成 DNA 雙鏈斷裂，從而實現(xiàn)靶位點堿基序列缺失，實現(xiàn)基因敲除。

3 gRNA 序列信息

4.構(gòu)建PE誘導(dǎo)的心肌肥大細胞模型，檢測ArmH4過表達以及敲低后心肌肥厚分子標(biāo)志物水平，分別提取總RNA，將內(nèi)源性GAPDH的mRNA含量設(shè)為對照，通過qRT-PCR檢測心肌肥厚指標(biāo)Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertuophic cardiomyopathy, HCM) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和( 或) 右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。 臨床表現(xiàn)：1.以青壯年多見、常有家族史。 2.可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。 3.梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。 臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、Nap1l5基因信息? 敲除基因名稱（ NCBI 號）： Nap1l5（ 58243）敲除基因 NCBI 網(wǎng)址鏈接： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58243敲除基因名稱（ MGI 號）： Nap1l5（ MGI: 1923555）敲除基因 Ensembl 網(wǎng)址鏈接：)，它們的印記狀態(tài)在人類和小鼠之間保存。在分子水平上，印跡基因由染色質(zhì)標(biāo)記的表觀遺傳標(biāo)記控制，包括DNA甲基化或抑制組蛋白修飾，以沉默一個親本等位基因，從而導(dǎo)致單等位基因表達[4]。父母的沖突或親屬關(guān)系理論提出的摩爾和黑格表明[5],在哺乳動物中,父親一般地表達了印跡基因作用于胎盤促進萃取母親提高后代的資源開發(fā)和健身,而母親般地印跡基因表達行為限制保護產(chǎn)婦胎兒生長資源長期母親的生殖健康。印跡基因還可以通過影響細胞增殖或凋亡直接作用于胎兒，也可以通過影響母體營養(yǎng)物質(zhì)通過胎盤的通量來影響胎兒生長。最近的證據(jù)也表明，印跡基因在認知行為中的作用，因為父系表達的Peg3基因失活研究表明，小鼠缺乏母性照料，從父親那里遺傳了一個空等位基因的雌性小鼠，會導(dǎo)致泌乳能力減弱，無法養(yǎng)育幼鼠[6]。一些實驗室的工作也表明，通過體細胞核移植克隆的動物的不完全表觀遺傳重編程導(dǎo)致印跡基因的異常表達，可能導(dǎo)致胎盤腫大[7, 8]。對這類基因的初步研究突出了其在一般生長發(fā)育中的重要作用[9]。最近，很明顯，這些基因也可能以一種高度特定的方式對大腦的發(fā)育和隨后的行為表型做出貢獻[10, 11]。 NAP1L5 (Nucleosome Assembly Protein 1 Like 5)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與NAP1L5相關(guān)的疾病包括Beckwith-Wiedemann綜合征。該基因的一個重要同源基因是NAP1L1。可以影響身體的幾個部分。嬰兒和兒童在8歲之前通常都比正常身高要大，這時生長速度減緩，導(dǎo)致成人的平均身高。身體的癥狀可能包括一方或地區(qū)越來越比另一邊(不對稱增長或hemihyperplasia)、臍膨出或其他腹壁缺陷出生時,低血糖(低血糖)在嬰兒期,異常大的舌頭(巨舌),異常大的腹部器官,折痕或坑附近的皮膚的耳朵,和腎臟異常。受影響的兒童罹患腫瘤的風(fēng)險更高，尤其是一種罕見的腎癌——Wilms腫瘤，一種肌肉組織癌——橫紋肌肉瘤，以及一種肝癌——肝母細胞瘤。然而，Nap1L5是否會參與免疫反應(yīng)，影響炎癥作用，以及在結(jié)核病及心血管疾病中的功能及作用機制還有待我們進一步探究。參考文獻：1. Mcgrath, J. and D. Solter, Completion Of Mouse Embryogenesis Requires Both the Maternal And Paternal Genomes. Cell, 1984. 37(1): p. 179-183.2. Monk, D., et al., Limited evolutionary conservation of imprinting in the human placenta. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2006. 103(17): p. 6623-6628.3. Morison, I.M., J.P. Ramsay, and H.G. Spencer, A census of mammalian imprinting. Trends In Genetics, 2005. 21(8): p. 457-465.4. Lewis, A., et al., Imprinting on distal chromosome 7 in the placenta involves repressive histone methylation independent of DNA methylation. Nature Genetics, 2004. 36(12): p. 1291-1295.5. Moore, T. and D. Haig, Genomic Imprinting In Mammalian Development - a Parental Tug-Of-War. Trends In Genetics, 1991. 7(2): p. 45-49.6. Li, L.L., et al., Regulation of maternal behavior and offspring growth by paternally expressed Peg3. Science, 1999. 284(5412): p. 330-333.7. Mann, M.R.W., et al., Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouse embryos. Biology Of Reproduction, 2003. 69(3): p. 902-914.8. Suemizu, H., et al., Expression profiling of placentomegaly associated with nuclear transplantation of mouse ES cells. Developmental Biology, 2003. 253(1): p. 36-53.9. Reik, W., et al., Imprinted genes and the coordination of fetal and postnatal growth in mammals. Novartis Found Symp, 2001. 237: p. 19-31; discussion 31-42.10. Davies, W., A.R. Isles, and L.S. Wilkinson, Imprinted genes and mental dysfunction. Ann Med, 2001. 33(6): p. 428-36.11. Isles, A.R. and L.S. Wilkinson, Imprinted genes, cognition and behaviour. Trends Cogn Sci, 2000. 4(8): p. 309-318.