該動(dòng)物模型主要是通過顯微注射法完成模型制備，再運(yùn)用基因組PCR方法對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)基因和敲除基因進(jìn)行鑒定和分析。

之前的HCV感染模型主要基于黑猩猩；由于小鼠易繁殖，基因操作性強(qiáng)，雖然HCV在小鼠上感染困難，但基于先進(jìn)的基因組操作技術(shù)，近幾年來，轉(zhuǎn)基因小鼠成為HCV模型研究熱點(diǎn)。主要有轉(zhuǎn)基因模型、異種移植小鼠。后者主要是通過將人肝細(xì)胞（如肝癌細(xì)胞系或者原代肝細(xì)胞）移植入小鼠體內(nèi)，形成人肝移植小鼠；該類免疫機(jī)能缺失小鼠模型不能用于研究宿主對(duì)HCV的特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)和再現(xiàn)病毒整個(gè)生命周期。前者通過表達(dá)HCV基因單個(gè)蛋白組分產(chǎn)物或基因多個(gè)蛋白組合產(chǎn)物模型和表達(dá)人宿主分子或失活小鼠抑制性分子構(gòu)建小鼠模型（人源化模型）。有研究通過瞬時(shí)表達(dá)HCV四受體分子于小鼠上卻并未取得成功感染，在此基礎(chǔ)上同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)人CD81和OCLN分子的近交鼠能使HCV成功感染{Giang, 2012 #193}{Dorner,2011 #194}。

該模型繼承了之前小鼠模型的方便繁殖等優(yōu)點(diǎn)，在前人基礎(chǔ)上運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和CRISPER/Cas9技術(shù)敲除相關(guān)基因，能提供HCV入侵受體的同時(shí)，敲除了STAT1能使天然免疫應(yīng)答受限但并未缺陷小鼠的適應(yīng)性應(yīng)答，更加利于HCV在小鼠體內(nèi)長期感染，用于HCV慢性感染研究，為疫苗探索提供模型基礎(chǔ)。

動(dòng)物模型制備過程中的監(jiān)督管理、處置措施、微生物菌株管理、細(xì)胞系描述、遺傳分析、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響的評(píng)估均符合相關(guān)規(guī)定。

模型構(gòu)建與檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：

對(duì)該動(dòng)物模型進(jìn)行HCV感染驗(yàn)證：尾靜脈注射HCV三個(gè)月后，對(duì)HCV RNA通過RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證：

除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備儀器為本技術(shù)領(lǐng)域常用試劑盒儀器，均可從商業(yè)途徑得到。pFUW-CSCO-4hEF載體質(zhì)粒是王天翼研究員惠贈(zèng)，見圖1所示

1） CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因ICR小鼠構(gòu)建（北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司）

pFUW-CSCO-4hEF載體質(zhì)粒經(jīng)過NdeI內(nèi)切酶（NEB， #R0111V；Cutsmart buffer： NEB， #B7204S）消化，得到線性DNA片段；將線性化DNA片段經(jīng)顯微注射入ICR小鼠受精卵，移入假孕小鼠子宮內(nèi)；小鼠出生后，提取基因組，采用跨啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物Primer1，檢測(cè)篩選得到的陽性F0小鼠（PCR產(chǎn)物片段為872bp），再用Primer2對(duì)插入的目的基因進(jìn)行檢測(cè)鑒定（PCR產(chǎn)物片段1643bp），獲得CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因ICR子代小鼠（簡稱4hEFTg）；

PCR特異性引物序列如下：

Primer1：

F：5’CGGAACAGGCGAGGAAAAGT

R：5’ACAAAACACACTCGCCAACC

Primer2：

F：5’ CCTGTCATCTGCCAAATCCG

R：5’ TACTGATCCACGTAGAGTCCA

PCR反應(yīng)體系：

PCR程序：

2）構(gòu)建純合STAT1-/-小鼠模型（北京華阜康生物科技股份有限公司）

針對(duì)STAT1基因第一外顯子和第二外顯子序列，設(shè)計(jì)2對(duì)sgRNA序列，通過構(gòu)建STAT1基因敲除載體并體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA

在NCBI上查詢小鼠STAT1基因信息，根據(jù)靶點(diǎn)序列和脫靶位點(diǎn)、發(fā)生錯(cuò)配可能性大小進(jìn)行設(shè)計(jì)和評(píng)估篩選，核苷酸序列和由公司（上海英濰捷基）合成的sgRNA序列如下所示；

位點(diǎn)1：actccaagttcctggagc agG

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up1 5’ATGGactccaagttcctggagc

m-STAT1-grna-down1 5’AAACGCTCCAGGAACTTGGAGT

位點(diǎn)2：cct cctctcacagctggacga

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up2 5’ATGGTCGTCCAGCTGTGAGAGG

m-STAT1-grna-down2 5’AAACcctctcacagctggacga

合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSAⅠ線性化的pUC57-sgRNA載體，通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA（體外轉(zhuǎn)錄試劑盒：Ambion Am1354）。

pST1374-NLS-flag-linker-Cas9載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉(zhuǎn)錄試劑盒：AmbionAm1345）。

經(jīng)顯微注射入ICR小鼠受精卵；

受精卵移植入ICR假孕雌鼠子宮；

小鼠出生7-10天后，剪取腳趾和尾尖，提基因組DNA（全式金Transgen公司的基因組DNA提取試劑盒 EE101-12），根據(jù)STAT1基因序列信息設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)引物（上海英濰捷基），經(jīng)PCR方法檢測(cè)敲除基因型，得到陽性F0代小鼠（STAT1+/-）;

PCR檢測(cè)引物：

m-STAT1-ko-S 5’gagagtaatttaatggttgggctc

m-STAT1-ko-A 5’CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAAC

TM=63℃

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序（TaKaRaRR042A）

反應(yīng)體系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)

2.0 μl

dNTP Mixture(2.5 μM)

1.6 μl

引物-S（50 μM ）

0.2 μl

引物-A（50 μM ）

0.2 μl

模板DNA

2.0 μl

LA Taq

0.2 μl

補(bǔ)加ddH2O至總體積

20.0μl

擴(kuò)增程序：

6×loadingbuffer 終止反應(yīng)。

用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

鑒定結(jié)果如圖2所示，鑒定出兩種條帶型，選取檢測(cè)分子量不同于野生型條帶的目的條帶進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。即獲得的小鼠為雜合子STAT1+/-小鼠（WT條帶大小：1081bp）；

F0代小鼠經(jīng)自交，出生小鼠經(jīng)基因組PCR方法鑒定，獲得純合STAT1-/-小鼠。

3）構(gòu)建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因合并STAT1基因敲除ICR小鼠動(dòng)物模型

將純合STAT1-/-小鼠與4hEFTg小鼠雜交，出生小鼠經(jīng)PCR方法檢測(cè)STAT1基因敲除情況和四受體基因表達(dá)情況（PCR檢測(cè)引物見上述構(gòu)建方法），獲得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因陽性STAT1雜合敲除的F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠；

F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠自交，出生小鼠經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)，鑒定STAT1基因敲除情況和四受體基因表達(dá)情況（PCR檢測(cè)引物見上述構(gòu)建方法），得到基因型，獲得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因陽性合并STAT1純合敲除的F2代4hEFTg STAT1-/-小鼠，即為小鼠動(dòng)物模型。

4）利用4hEFTg STAT1-/-小鼠進(jìn)行HCV感染評(píng)價(jià)

丙型肝炎病毒JFH1通過尾靜脈注射（1x10^7FFU）感染4hEFTg STAT1-/-小鼠，感染3月后取小鼠肝組織。用qRT-PCR方法（QIAGEN 210210）檢測(cè)肝細(xì)胞中的HCV RNA，1%DNA膠鑒定產(chǎn)物結(jié)果。相對(duì)于野生型ICR小鼠組，4hEFTg STAT1-/-小鼠組能檢測(cè)到HCV RNA，顯示4hEFTgSTAT1-/-小鼠能成功感染HCV。

丙型肝炎主要病因是丙型肝炎病毒感染引起，HCV感染極易慢性化，HCV感染與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。HCV的致病機(jī)制與病毒的直接致病作用和免疫病理損傷有關(guān)，包括HCV干擾細(xì)胞內(nèi)大分子合成等的直接殺傷作用、HCV特異性CD8和CD4 T細(xì)胞免疫應(yīng)答、宿主自身免疫因素的參與以及細(xì)胞凋亡。 HCV主要傳染源是急慢性患者和無癥狀病毒攜帶者，通過腸道外途徑如血制品、注射、密切接觸等傳播，人類普遍對(duì)HCV易感，目前尚無疫苗。 丙型肝炎臨床表現(xiàn)為急性肝炎包括急性黃疸型肝炎和急性無黃疸型肝炎；超過半年或原有肝炎急性發(fā)作后再次出現(xiàn)肝炎癥狀、體征和肝功能異常者發(fā)展為慢性肝炎，嚴(yán)重者在多種復(fù)雜因素下進(jìn)展為重型肝炎。根據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度，亞急性重型肝炎和慢加急性重型肝炎可分為早、中、晚期。除此之外，肝炎還表現(xiàn)為淤疸型肝炎、肝炎肝硬化。可發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥如肝性腦病、上消化道出血、肝腎綜合征和感染。

往往通過有無輸血及血制品、靜脈吸毒、血液透析多個(gè)性伴侶、不潔注射及紋身等病史，以及相應(yīng)肝功能臨床診斷，和有無HCV抗體IgM或IgG、HCV RNA陽性進(jìn)行診斷。

1、CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體基因和STAT1基因信息

CD81(gen ID：975)、CLDN1(genID：9076)、OCLN(gen ID：100506658)、SRB1(genID：949)、STAT1（genID：6772）從GenBank數(shù)據(jù)庫上獲得。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇遠(yuǎn)交系ICR品系，是1973年從日本國立腫瘤研究所引進(jìn)。購于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。此鼠溫順，生育能力高。

3、研究背景

丙型肝炎病毒（HCV）是經(jīng)血液傳播病毒，感染人類后易慢性化。病毒的持續(xù)存在可使肝炎向肝脂肪病變、肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌進(jìn)展，嚴(yán)重威脅人類健康。在世界范圍，據(jù)估計(jì)，2015年病毒性丙型肝炎的患病率為1.0%（95%的不確定區(qū)間為0.8-1.1），有7100萬（62.5-79.4）為慢性病毒性感染。目前尚無HCV疫苗，而疫苗研發(fā)難點(diǎn)除了HCV基因組差異大，不同基因型的病毒序列差異可高達(dá)50%{Bukh, 1995 #111}{Simmonds, 2005 #112}，在感染機(jī)體內(nèi)常以準(zhǔn)種形式存在外，目前缺乏合適的動(dòng)物模型也限制了HCV疫苗的研發(fā)應(yīng)用。

HCV自然宿主是人和黑猩猩，由于靈長類動(dòng)物費(fèi)用高和倫理問題復(fù)雜，限制了該類動(dòng)物的應(yīng)用。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在小型動(dòng)物模型上進(jìn)行各種嘗試，已取得部分進(jìn)展，主要有：

（1）樹鼩模型：樹鼩對(duì)HCV易感，一些動(dòng)物在初次感染3年后疾病可進(jìn)展成肝纖維化和肝硬化{Amako,2010 #155}。但樹鼩屬于野生動(dòng)物，遺傳品系不穩(wěn)定，應(yīng)用受限。

（2）HCV基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型：可表達(dá)表達(dá)HCV基因單個(gè)蛋白組分產(chǎn)物或基因多個(gè)蛋白組合產(chǎn)物，但會(huì)由于表達(dá)HCV產(chǎn)物的不同、小鼠背景的差異性或HCV蛋白表達(dá)所用啟動(dòng)子不同而出現(xiàn)組織病理報(bào)告差異大，表現(xiàn)為不同程度的肝疾病，使針對(duì)發(fā)病機(jī)制研究時(shí)需要多加注意。

（3）異種移植小鼠模型：通過將人肝細(xì)胞（如肝癌細(xì)胞系或者原代肝細(xì)胞）移植入小鼠體內(nèi)，形成人肝移植小鼠。該類小鼠模型免疫缺陷，不能用于研究宿主抗HCV的特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)和再現(xiàn)病毒整個(gè)生命周期。

（4）宿主因子人源化小鼠模型：在HCV感染人體過程中有四個(gè)（CD81、SCARB1、CLDN1和OCLN）入侵必需宿主因子，其中CD81第二個(gè)包外環(huán)關(guān)鍵氨基酸殘基和OCLN分子是阻止HCV入侵嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的原因。利用腺病毒瞬時(shí)表達(dá)人CD81單分子或同時(shí)表達(dá)人CD81、SCARB1、OCLN和CLDN1四種分子的小鼠模型卻并未成功建立HCV感染{Masciopinto, 2002#191}{Hikosaka, 2011 #192}。在近交鼠上同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)人CD81和OCLN分子能使HCV成功入侵，但小鼠的免疫系統(tǒng)限制了HCV的感染{Dorner, 2011 #194}，在此基礎(chǔ)上敲除STAT1-/-，該小鼠能成功建立HCV感染，并能激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

為解決現(xiàn)有丙型肝炎病毒感染小鼠模型缺乏，目的在于提供了一種構(gòu)建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉(zhuǎn)基因合并STAT1基因敲除小鼠模型，用于HCV感染動(dòng)物模型和HCV疫苗探索研究的模型基礎(chǔ)。