Enpp1基因編碼的蛋白是一種II型跨膜糖蛋白，屬于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早發(fā)現(xiàn)于漿細(xì)胞（PC）中；在許多非淋巴組織中表達(dá)，包括軟骨、心臟、腎臟、肝臟和唾液腺，并在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)；參與多種生物學(xué)途徑。對(duì)于Enpp1基因進(jìn)行失活突變或基因沉默的小鼠，由于關(guān)節(jié)和椎旁韌帶過度鈣化，表現(xiàn)出“關(guān)節(jié)僵硬”和“踮腳走路”的表型。Enpp1突變也會(huì)導(dǎo)致小鼠和人類的血管鈣化，導(dǎo)致人類常染色體隱性低磷血癥性佝僂病(ARHR)或嬰兒期廣義動(dòng)脈鈣化(GACI)。Enpp1突變模型也表現(xiàn)出過早老化的表型，如壽命短和動(dòng)脈硬化，可應(yīng)用于衰老研究。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

條件性Enpp1-Floxp敲除小鼠雜合子采用PCR方式進(jìn)行基因敲除的鑒定。

（1）引物信息：見表1

表4. 鑒定引物序列

引物不同組合檢測分析：

F1+R1引物PCR檢測L端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：225 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：225 bp，一條為WT：191 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：225 bp帶

F2+R2引物PCR檢測R端floxp插入情況：

①純合子（f/f）：只有一條KI：236 bp帶

②雜合子（f/w）：兩條帶，一條為KI：236 bp，一條為WT：202 bp

③野生型（wt）：只有一條WT：202 bp帶

F+R引物PCR檢測兩端floxp插入情況：

需要測序判斷，測序引物為F(或R1)和F(或F2)

①純合子（f/f）：測序峰型為單峰，比對(duì)與Donor序列一致，插入兩個(gè)floxp序列

②雜合子（f/w）：測序峰型為雙峰，能讀出含有floxp序列的套峰

③野生型（wt）：測序峰型為單峰，比對(duì)與野生型序列一致

測序結(jié)果：將F/R 引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物測序確認(rèn)該小鼠為均為兩端準(zhǔn)確插入floxp列的雜合子，具體見圖3。黑色箭頭代表野生型序列，紅色箭頭代表插入的序列，L端和R端測序的峰形分析，都可確認(rèn)該小鼠floxp序列（ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT）準(zhǔn)確插入指定位置。說明條件性Enpp1-floxp敲除小鼠構(gòu)建成功。

L端floxp插入分析（測序引物：F）

R端flxop插入分析（測序引物：R）

圖3. F/R 引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果

基因敲除構(gòu)建設(shè)計(jì)：

低磷性佝僂病（Hypophosphatemicriskers）是兒童常見的代謝性骨病，是由于各種原因引起腎小管對(duì)磷的重吸收障礙，從而導(dǎo)致骨發(fā)育不良的一組腎失磷性代謝性骨病，臨床表現(xiàn)為低磷血癥、身材矮小、雙下肢骨骼畸形。兒童期的低磷性佝僂病多為遺傳性，包括常染色體顯性遺傳（ADHR）、常染色體隱性遺傳（ARHR）、X連鎖遺傳（XLHR）、伴高鈣尿癥的遺傳性低磷性佝僂病（HHRH）等。Enpp1基因是已確定的可導(dǎo)致低磷性佝僂病的基因之一，屬于常染色體隱性遺傳。嬰兒全身動(dòng)脈鈣化(Generalized Arterial Calcification of Infancy，GACI)是少見的疾病，其特點(diǎn)是伴不規(guī)則內(nèi)膜增厚的彌漫性動(dòng)脈鈣化，冠狀動(dòng)脈受累，通常在9個(gè)月前死亡。Enpp1基因也被證實(shí)與GACI有關(guān)。它編碼的蛋白是一種II型跨膜糖蛋白，屬于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早發(fā)現(xiàn)于漿細(xì)胞（PC）中；在許多非淋巴組織中表達(dá)，包括軟骨、心臟、腎臟、肝臟和唾液腺，并在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)；參與多種生物學(xué)途徑。首先，ENPP1蛋白具有廣泛的底物特異性，包括ATP、UTP、cAMP和2'3'-cGAMP。該酶催化5' -磷酸二酯酶鍵，主要在ATP中，生成核苷5'-單磷酸和無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)，后者是骨形成過程中礦物結(jié)晶的抑制劑。對(duì)于Enpp1基因進(jìn)行失活突變或基因沉默的小鼠，由于關(guān)節(jié)和椎旁韌帶過度鈣化，表現(xiàn)出“關(guān)節(jié)僵硬”和“踮腳走路”的表型。Enpp1突變也會(huì)導(dǎo)致小鼠和人類的血管鈣化，導(dǎo)致人類常染色體隱性低磷血癥性佝僂病(ARHR)或嬰兒期廣義動(dòng)脈鈣化(GACI)。其次，ENPP1通過將ATP分解為AMP來介導(dǎo)核苷酸循環(huán)，而AMP再被5'核苷酸酶轉(zhuǎn)化為腺苷，腺苷則被自由地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中進(jìn)行新陳代謝。ATP和腺苷都具有免疫調(diào)節(jié)功能。第三，ENPP1參與脂肪細(xì)胞分化，并在碳水化合物代謝和胰島素抵抗中發(fā)揮作用；ENPP1與胰島素受體結(jié)合，抑制下游信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)胰島素抵抗和葡萄糖耐受。第四，ENPP1對(duì)于正常B細(xì)胞的發(fā)育是必不可少的，而且對(duì)于長壽漿細(xì)胞（LLPC）的發(fā)育和生存更是至關(guān)重要。Enpp1突變模型也應(yīng)用于衰老研究。