該模型采用了CRISPR/Cas9技術，創(chuàng)新性地結合了人類遺傳學與動物基因編輯技術，首次在小鼠上重構了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區(qū)域的亞效等位基因，并將二者結合，形成復合雜合突變并獲得相應的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創(chuàng)的復合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側凸的分子機制和發(fā)病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環(huán)境（北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心）內進行繁育、飼養(yǎng)及相關實驗，其監(jiān)督管理措施由動物中心負責。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發(fā)病幾率。嚴格實驗室管理，防止小鼠外泄，實驗設計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態(tài)環(huán)境。

1. 劑量依賴性的先天性椎體畸形復合遺傳模型

使用小鼠胚胎的體內測定，我們展示了劑量依賴性的先天性椎體畸形復合遺傳模型。該模型由Tbx6無效等位基因 (?) 和亞等位基因（mh）組成。(A) 阿爾新藍染色的E14.5小鼠胚胎的背面視圖。顯示了一個沒有明顯椎體畸形的胚胎。(B) 顯示了一個具有椎體畸形的胚胎。紅點和箭頭分別表示椎體畸形和肋骨融合。比例尺為1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ? 的E14.5小鼠胚胎中未觀察到明顯的椎體畸形，而Tbx6 mh / ? 胚胎表現出高穿透率的椎體畸形。樣本量顯示在下面的列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的Micro-CT結果

成年小鼠的Micro-CT結果。(A) 通過Micro-CT掃描顯示成年小鼠的背側和腹側圖像，未見明顯椎體畸形。(B) 通過Micro-CT掃描顯示一只具有椎體畸形的小鼠。 白色箭頭和箭頭分別指示椎體畸形和肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ? 基因型的成年小鼠Micro-CT圖像。 樣本量顯示在每列下方。 ****，P ＜0.0001。

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

采用CRISPR-Cas9技術編輯小鼠基因組。表 1中顯示了小鼠基因組中指導RNA的靶標。我們混合了向導RNA和Cas9mRNA（每個RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的合子（每次注射編輯200個細胞）。取得F0小鼠后，與野生型FVB / NJ小鼠雜交以獲得后代。我們使用來自腳趾的基因組DNA，通過PCR和Sanger測序對小鼠進行基因分型。用于擴增和測序的PCR引物在表 2中顯示。

表 1. 小鼠基因組中單向導RNA（sgRNA）的靶序列。

表 2. 小鼠Tbx6基因分型的引物。

先天性脊柱側凸即通過X線，MRI或手術證實的特定的先天性椎體異常而引起的脊柱側凸。這種畸形出生后即發(fā)病，因而患者出現畸形較特發(fā)性脊柱側凸早。早期發(fā)病使先天性脊柱側凸患者很少能接受到早期最佳的治療。由于形成的彎曲易于進展，并且患者仍有較長的生長期，所以容易產生較嚴重的畸形。先天性脊柱側凸通常較僵硬，難于矯正。根據畸形的類型對脊柱側凸進行分型，主要分為形成障礙，分節(jié)不良和混合畸形。形成障礙最典型的例子即半椎體；典型的分節(jié)不良為骨橋，即兩個或多個椎體一側或雙側的骨性連接；混合型即同一患者同時具有以上2種畸形。