慢性束縛應(yīng)激作為一種非損傷性刺激，能有效地引起典型的非特異性應(yīng)激反應(yīng)，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性，是目前應(yīng)用最廣泛的一種抑郁癥動物模型。與獲得性無助、不可預(yù)測性應(yīng)激等慢性心理應(yīng)激模型相比，是建立單純心理應(yīng)激所致情緒障礙等神經(jīng)精神疾病更適宜的造模方法。

研究報道，慢性應(yīng)激抑郁模型會導(dǎo)致動物體重下降，14 h /28 d CRS 組雌雄大鼠與相應(yīng)對照組比較體重顯著下降，而10 h /28 d CRS組大鼠無顯著性差異。一般認(rèn)為抑郁動物的活動度減少，在陌生的環(huán)境里會減少對中央?yún)^(qū)域的探索。14 h /28 d CRS 組雌雄大鼠運(yùn)動路程和時間、中央?yún)^(qū)活動路程和時間等指標(biāo)顯著減少，表明其對新奇環(huán)境好感度降低，表現(xiàn)出抑郁癥的特征。10 h /28 d CRS僅雄性組在中央?yún)^(qū)運(yùn)動時間減少。

機(jī)體獎賞系統(tǒng)的閾值增加，快感缺失為抑郁癥的一個主要的癥狀，糖水偏愛實(shí)驗則是目前使用最為廣泛的一個用于評價快感缺失的動物行為學(xué)測試方法，14 h/28 d CRS 組動物糖水偏愛指數(shù)顯著降低表明其具有快感缺失的抑郁樣行為，而10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比均無顯著性差異。

新奇事物實(shí)驗是研究動物自發(fā)探索行為的一種方法。動物在已熟悉的空場環(huán)境中面臨新奇事物時，產(chǎn)生既對新事物好奇又對新事物恐怖的矛盾沖突，出現(xiàn)接近-回避的沖突行為。抑郁動物在新奇事物實(shí)驗中的探索行為減少，14 h /28 d CRS 組的雌雄性大鼠與對照組相比探索次數(shù)、探索時間明顯下降，潛伏期時長顯著增多，表明動物對新奇環(huán)境的探究能力下降，其對事物失去興趣。10 h /28 d CRS 組僅雄性大鼠的潛伏期明顯延長，探索時間縮短。

有文獻(xiàn)指出慢性應(yīng)激刺激對誘導(dǎo)雌雄大鼠抑郁樣行為敏感性不同。為證實(shí)此本實(shí)驗對雌雄鼠進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，14 h/28d CRS雌雄大鼠的糖水偏愛指數(shù)及差值極顯著低于對照組。10 h /28 d CRS雄性組在中央?yún)^(qū)運(yùn)動時間比對照組顯著減少，而雌性組各指標(biāo)均無顯著性差異。10 h /28 d CRS組雄性大鼠的潛伏期顯著延長，探索時間明顯縮短，而對應(yīng)的雌性組大鼠僅潛伏期顯著延長。這提示雄鼠可能對CRS更為敏感，更易表現(xiàn)出抑郁樣行為。

此外，本實(shí)驗室亦報道了慢性束縛6h/28天致使雄性Wistar大鼠表現(xiàn)出抑郁行為。在10h/28天束縛應(yīng)激雌雄大鼠表現(xiàn)出一定的性別差異，雌性鼠對應(yīng)激的的耐受力更強(qiáng)，CRS更易致雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。而慢性束縛應(yīng)激（14h/28天）能顯著表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁樣行為，性別差異對其無影響。故我們推薦慢性束縛應(yīng)激6~14h/28天雄性大鼠均能表現(xiàn)出抑郁樣行為，在10h/28天束縛應(yīng)激SD雌雄大鼠均表現(xiàn)出一定的性別差異，雌性鼠對應(yīng)激的的耐受力更強(qiáng)。而慢性束縛應(yīng)激（14h/28天）SD雌雄均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁樣行為。由此得出連續(xù)28 d、每天束縛14 h建立的抑郁癥動物模型是一種更穩(wěn)定的抑郁模型。

應(yīng)激作用下會使得機(jī)體皮質(zhì)酮含量升高，高皮質(zhì)酮也會誘發(fā)抑郁樣行為。持續(xù)注射皮質(zhì)酮會使得大鼠出現(xiàn)快感缺失、行為絕望等抑郁樣表現(xiàn)。臨床數(shù)據(jù)也顯示大部分抑郁癥患者的皮質(zhì)酮水平明顯升高。本研究中發(fā)現(xiàn)CRS 14h/28天升高了SD血清中的皮質(zhì)酮含量，而采用陽性藥西酞普蘭與應(yīng)激組相比顯著降低了皮質(zhì)酮水平，表明慢性束縛應(yīng)激（14h/28天）可能通過升高血清皮質(zhì)酮含量，提高HPA軸興奮，產(chǎn)生抑郁樣行為。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于由于束縛器是樹脂材料的圓柱形，頂端有數(shù)個通氣的小孔，各組動物體重應(yīng)控制在適宜范圍之內(nèi)，滿足其在束縛器中身體不能翻轉(zhuǎn)，只能保持頭部活動保持正常呼吸。另外，在束縛早期由于動物掙扎劇烈，會出現(xiàn)動物窒息的情況，所以一開始需要我們24 h觀察，及時排除動物窒息死亡的情形。

與其他應(yīng)激模式不同：慢性束縛應(yīng)激是將動物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動的方式（非損傷性刺激），能有效地引起典型的非特異性應(yīng)激反應(yīng)，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性，是目前應(yīng)用最廣泛的一種抑郁癥動物模型。

本實(shí)驗采用健康成年SPF級大鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗動物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗。實(shí)驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1 實(shí)驗材料

（1）藥品與試劑：

鹽酸西酞普蘭 (西安楊森制藥有限公司，中國，批號為22730060)、大鼠皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，中國)

（2）儀器：

① 行為學(xué)檢測：空場、糖水偏愛、新奇事物探索

②蛋白含量檢測：全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）、超聲細(xì)胞破碎儀（美國Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。

2 評價方法

（1）行為學(xué)評價:

①空場：

利用自主活動實(shí)驗計算機(jī)圖像實(shí)時監(jiān)測分析處理系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗，該系統(tǒng)由自主活動測試箱、攝像系統(tǒng)和圖像采集分析系統(tǒng)三部分組成。自主活動測試箱由4個圓柱形桶構(gòu)成，攝像頭系統(tǒng)對測試動物進(jìn)行實(shí)時檢測，并將動物的運(yùn)動信息傳送給視頻卡，并通過軟件對動物的運(yùn)動信息進(jìn)行分析處理。將大鼠置于測試箱適應(yīng)2-3min后再進(jìn)行測試，測試時間為10 min，測試時保持周圍環(huán)境的安靜，點(diǎn)擊開始后圖像采集分析系統(tǒng)自動記錄各項數(shù)據(jù)。

②糖水偏愛實(shí)驗:

在造模前進(jìn)行訓(xùn)練和糖水偏愛測試（基線），基線測試即在大鼠禁食禁水23小時后，測定第24小時內(nèi)的糖水/純水的消耗量，計算糖水偏愛指數(shù)（糖水偏愛指數(shù)=糖水消耗/總液體消耗×100%)。造模28天后，再進(jìn)行一次糖水偏愛測試，觀察束縛大鼠的糖水偏愛指數(shù)的變化差異。

③新奇事物實(shí)驗：

于自主活動實(shí)驗次日將大鼠放入自主活動測試箱中測試。測試前在測試箱中央放入一個藍(lán)色的圓柱體新奇事物。實(shí)驗時將大鼠面向測試箱壁放入，并記錄10 min 內(nèi)首次探索新奇事物的時間（即潛伏期，10 min內(nèi)無探索行為，則潛伏期時間記為10 min）、探索次數(shù)以及探索時間。

（2）皮質(zhì)酮含量的測定

大鼠斷頭取血后將血液靜止24 h，室溫下3000r /min 離心10 min，取上清， 于4℃下8000 r/min離心10 min，取上清置于－80℃冰箱保存。采用ELISA法檢測皮質(zhì)酮含量，按說明書操作，利用全自動酶標(biāo)儀檢測吸光度，吸光度的檢 測波長為450 nm評價結(jié)果。

（3）行為學(xué)結(jié)果

① 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重的影響

如表1 所示，從第15 天開始，14h /28 d CRS 組雌性和雄性大鼠的體重均顯著下降(P＜0. 01) 。而10 h /28 d CRS 組雌雄性大鼠與對體重?zé)o顯著性差異。

表1 慢性束縛應(yīng)激對大鼠體重的影響( n = 10，Mean±SEM)

注：與對照組相比*p<0.05；** P<0.01.

②慢性束縛應(yīng)激對大鼠糖水偏愛指數(shù)的影響

如表2 所示，第1天糖水基線測試表明CRS 組雌雄性大鼠各組間的糖水偏愛指數(shù)無差異。與糖水基線比較，14 h /28 d CRS雄性組糖水偏愛指數(shù)水平明顯下降(P＜0. 01)。與對照組相比，14 h /28 d CRS 雄性組的糖水偏愛指數(shù)及差值極顯著低于對照組(P＜0. 01)。與糖水基線比較，14 h /28 d CRS 雌性組糖水偏愛指數(shù)水平明顯下降(P＜0. 05)。與對照組相比，14 h /28 d CRS 組的糖水偏愛指數(shù)差值極顯著低于對照組(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比，均沒有顯著性差異。

表2 慢性束縛對大鼠糖水偏愛指數(shù)的影響( n = 10，Mean±SEM)

注: 與對照組相比，* P＜0. 05，**P＜0. 01。與糖水基線比較，＆P＜0. 05，＆＆P＜0. 01。

③慢性束縛應(yīng)激對大鼠自主活動的影響

如表3 所示，與對照組相比，14 h /28 d CRS 組雄性大鼠的運(yùn)動路程、運(yùn)動時間、中央運(yùn)動時間均極顯著減少(P＜0. 01)，靜息時間顯著增加( P＜0.05)。同樣，與對照組相比，14 h /28 d CRS 組雌性大鼠CRS 組的運(yùn)動路程、運(yùn)動時間、中央運(yùn)動時間以及外周運(yùn)動時間均極顯著減少(P＜0.01)，靜息時間顯著增加(P＜0. 01)。10 h /28 d CRS 雄性組大鼠除在中央?yún)^(qū)運(yùn)動時間比對照組少(P＜ 0. 05)，其他指標(biāo)無顯著差異。10 h /28 d CRS 雌性組的模型和對照組相比各指標(biāo)均無顯著性差異。

表3 慢性束縛對大鼠自主活動的影響( n = 10，Mean±SEM)

④ 慢性束縛應(yīng)激對大鼠新奇事物探索行為的影響

如表4 所示，14 h /28 d CRS 組的雌雄性大鼠與對照組相比，潛伏期顯著升高(P＜0. 01)，探索次數(shù)、探索時間明顯下降(P＜0. 01)。14 h/28 d CRS雌性組的探索時間明顯比對應(yīng)雄性組長(P＜0. 05)，而14 h /28 d 雌性對照組的探索時間明顯比對應(yīng)的雄性組短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS 雄性組大鼠的潛伏期顯著增長(P＜0. 05) ，探索時間明顯減短(P＜0. 05)。10 h /28 d CRS雌性組大鼠僅潛伏期顯著增長(P＜0. 05) ，探索次數(shù)及探索時間和對照組相比則無明顯變化。

表4 慢性束縛應(yīng)激對大鼠在新奇事物實(shí)驗中探索行為的影響( n = 10，Mean±SEM)

注：與對照組相比，*P＜0. 05，**P＜0. 01。與對應(yīng)雄性組相比，#P＜0. 05，##P＜0. 01。

（4）血清皮質(zhì)酮檢測結(jié)果

如表5，相比于對照組，模型組的血清皮質(zhì)酮含量(P＜0. 01)明顯增高，陽性藥西酞普蘭組相較于模型組動物的皮質(zhì)酮水平也明顯下降(P＜0. 05)。

表 5 慢性限制活動對SD雄性大鼠皮血清皮質(zhì)酮水平的影響 ( n = 15, Mean±SEM)

注：與對照組相比，**P＜0. 01；與空白組相比，#P＜0. 05

1 動物：清潔級Sprague-Dawley 大鼠，雌雄各半

2 材料：行為限制器、醫(yī)用棉簽

3 儀器：無

4 模型誘導(dǎo)方法：

慢性束縛組大鼠每天早上9:00開始束縛，束縛強(qiáng)度為6h和14h，連續(xù)束縛28天。束縛時將動物放進(jìn)大鼠束縛器內(nèi)（直徑 6.0 cm，長 21.0 cm），用底座固定，保持大鼠四肢固定，不能自由轉(zhuǎn)身。束縛器頂部及四周有數(shù)個孔洞，以保持束縛器內(nèi)空氣流通，以防動物窒息死亡。束縛期間，模型大鼠放在臨近的隔壁房間，正常組與束縛大鼠隔開，去除束縛后再放回原來的動物籠中。

圖1 行為限制器的大鼠束縛裝置圖

抑郁癥是一種常見的神經(jīng)精神疾病，患者常表現(xiàn)出情緒低落、消極、悲觀、內(nèi)疚、注意力不集中、對事物失去興趣、睡眠和飲食障礙等特點(diǎn)，嚴(yán)重者甚至?xí)a(chǎn)生自殺的想法[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前約共有3.5億名抑郁癥患者[2]。束縛應(yīng)激，是一種將動物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動的方式，模擬人類社會中無法避免的擁擠、壓力性空間等應(yīng)激因素，是目前建立單純心理應(yīng)激所致情緒障礙等神經(jīng)精神疾病應(yīng)用最廣泛的造模方法之一[3-5]。

文獻(xiàn)中關(guān)于建立該模型所使用的大小鼠品系繁多。慢性束縛應(yīng)激動物模型都采用常用的模式動物, 如大鼠和小鼠。多選用封閉群 Sprague-Dawley、 Wistar大鼠、ICR小鼠、C57BL /6J小鼠等[6-9]。雄性多見。目前，文獻(xiàn)報道的造模時間大多在4 -8 h/day、連續(xù)14-48 d [10]。本研究在前期實(shí)驗研究和文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)軍隊6-14 h進(jìn)行探究，本文選用10和14h，28d天觀察對雌雄大鼠抑郁行為的影響，確定該模型誘導(dǎo)的抑郁模型為現(xiàn)代人類長期處于慢性應(yīng)激作用下誘發(fā)的抑郁癥機(jī)理研究、防護(hù)和藥物研究提供實(shí)驗?zāi)Ｐ汀?/p>

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